| 荧光光谱分析实验
来源：分析测试中心 发布时间：2013-12-02 一、实验目的 1、了解荧光分析法的基本原理 2、学会荧光光谱仪的操作 3、通过实验了解荧光分析法的定性定量分析应用。 二、实验要求 要求同学掌握荧光光谱仪的结构和工作原理，通过实验了解酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）是天然氨基酸中仅有的能发射荧光的组分，可以直接进行荧光分析。荧光强度大小受那些因素影响及比较不同浓度溶液的荧光强度与溶液浓度的关系曲线，解释产生差异的原因。怎样利用同步荧光技术来减小散射光影响。 三、实验原理 荧光是分子从激发态的最低振动能级回到原来基态时发射的光。利用物质被光照射后产生的荧光辐射对该物质进行定性分析和定量分析的方法，称为荧光分析。 在一定光源强度下，固定激发波长(λex)，扫描得到的荧光强度与发射波长(λem)的谱图称为荧光的发射光谱；反之，固定发射波长(λem)，扫描得到的荧光强度与激发波长(λex)的谱图则为荧光激发光谱。 在一定条件下，荧光强度与物质浓度成正比，即F=KC这是荧光定量的基础。以荧光强度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，在相同的条件下，测样品的荧光强度，从标准曲线上求出含量。 恒波长同步荧光分析法是在同时扫描过程中使激发波长（λem）和发射波长保持固定波长间隔（△λ=λem—λex=常数）。酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）是天然氨基酸中仅有的能发射荧光的组分，可以用荧光分析法测定,但它们的激发光谱和发射光谱有互相重叠的现象。用同步扫描荧光光谱技术可以简化、窄化光谱，减小光谱的重叠性，减小散射光影响，提高选择性。 四、仪器与试剂 1、LS-55型荧光光谱仪(美国PE公司); 2、移液管、容量瓶、烧杯；KQ5200B型超声波清洗器; 3、氨基酸储备液：色氨酸4μg/mL ：准确称取0.004g色氨酸，溶于少量水中，超声10分种，至完全溶解，移至100mL容量瓶中用水定容,低温保存。使用时稀释10倍。 苯丙氨酸100μg/mL：准确称取0.01g苯丙氨酸，溶于少量水中，超声5分钟，至完全溶解，移入100mL溶量瓶中用水定容。低温保存。 4.、去离子水 五、实验内容与步骤 1. 色氨酸标准溶液的配制：取4个50mL容量瓶，以次加入0.5, 1.0,1.5, 2.0mL4μg/mL使用溶液，加去离水定容至刻度，此色氨酸浓度为0.04 , 0.08, 0.12 , 0.16μg/mL 。 苯丙氨酸溶液的配制：取5mL苯丙氨酸储备液于50mL容量瓶中，加去离子水，即为10μg/mL。 2. 打开电脑和光谱仪主机，仪器自动校验约10分钟。设定仪器参数，分别对两种氨基酸溶液测量它们的光谱图。 2.1扫描激发光谱与发射光谱： 以下为光谱扫描参数： 波长范围 (nm) λex (nm) λem (nm) EXSlit (nm) EmSlit (nm) Speed (nm/min) 色氨酸 （Trp） 200-330 280-420 215 360 10.0 5.0 1000 苯丙氨酸（Phe） 200-350 250-360 206 287 10.0 5.0 1000 将0.12μg/mL色氨酸溶液移入荧光池内至2/3体积，放入仪器样品室，依据荧光强度值调节仪器的灵敏度等各项参数，测定其激发光谱与荧光光谱，记录信息。 2.2 荧光强度与浓度的关系 在同样的仪器条件下依次按如下顺序测定不同浓度的色氨酸溶液荧光光谱：0.04, 0.08 , 0.12 ,0.16μg/mL。记录荧光强度值。 2.3同步荧光光谱 依据0.12μg/mL色氨酸溶液的荧光强度值重新调节仪器参数： 波长范围 (nm) △λ（λem—λex） （nm） ExSlit (nm) EmSlit (nm) Speed (nm/min) 色氨酸 （Trp） 200-350 145 10.0 4.0 1000 苯丙氨酸（Phe） 200-300 81 10.0 4.0 1000 （注意：由于物质的荧光性质受许多条件的影响，以上实验参数仅供参考，具体参数的选择视实际情况而定） 六、数据处理 1、用实验获得的数据绘制两种氨基酸的激发、发射、同步光谱图。（两种氨基酸光谱图各打印于同一张图纸上） 2、由系列标准色氨酸溶液的荧光光谱，以最大发射波长荧光强度对溶液浓度图求出标准曲线回归方程式及相关系数。（荧光光谱重叠打印于同一张图纸上） 3、激发和发射光谱中找出最大激发波长和最大发射波长值，以及它们相对应的峰高。在它们的同步荧光光谱中也确定最大波长和对应的峰高。 |